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David W. Burden, Ph.D.
BT&C, Inc., Life Science Consulting & Contract Research, P.O.Box 348 lebanon,
New Jersey 08833. Email: biotecinfo@aol.com
La criopreservación de células y tejidos animales ha sido tradicionalmente lograda utilizando congeladores y termos con nitrógeno líquido. Con los cambios tecnológicos en la ciencias biológicas, dos importantes problemas han surgido de esta forma de criopreservación, el primero fue la contaminación de las muestras menos sumergidas y el segundo la observación de que la fase de vapor de los sistemas de criopreservación podían presentar gradientes de temperatura que superaban la temperatura de transición vítrea del agua. Para solucionar estos problemas, se pueden utilizar congeladores mecánicos auto-cascada para la preservación de células y tejidos animales debajo de la temperatura de transición vítrea del agua, -130ºC, .Los datos de temperatura obtenidos de la cámara del criocongelador Revco están por debajo de los -130ºC, a diferencia de los obtenidos en la fase vapor del nitrógeno líquido que han llegado a registrarse tan altos como -72ºC. Además, como los tubos de criopreservación no se sumergen en los congeladores mecánicos, los problemas de contaminación disminuyen. La ausencia de contaminación cruzada durante la permanente criopreservación de las muestras por debajo de los -130ºC está permitiendo el novedoso uso de los criocongeladores para la criopreservación de células en microplacas de cultivo celular.
Introducción
La preservación no destructiva del material biológico depende del detenimiento de la degradación enzimática y espontánea a la vez que se conserva la forma y la función del material biológico. No solamente se requiere la integridad del material biológico sino también el mantenimiento de su estructura espacial (por ejemplo la estructura de plegamiento en las proteínas) y el mantenimiento de su actividad biológica. Básicamente tanto el aspecto macroscópico como el molecular del material preservado tienen que ser mantenidos. Existen varias formas de conservación y estas incluyen bajas temperaturas, la reducción del agua y el agregado de conservadores químicos. Estos métodos pueden utilizarse por separado o en combinación. La naturaleza del material biológico, según sea una proteína o una muestra de tejido, determinará los métodos a ser utilizados para su preservación.
En el caso de muchos microorganismos y sustancias biológicas, la preservación se logra removiendo el agua que contienen, lo cual detiene la actividad biológica y las reacciones de degradación. Esto puede llevarse a cabo por liofilización, por ejemplo mediante el proceso de secado por congelación al vacío. Si bien la liofilización es ampliamente utilizada, no es apropiada para sistemas más complejos tales como las células de mamíferos en cultivo. En este caso, la reducción de la actividad del agua es lograda por congelamiento lo cual también tiene la ventaja de reducir la velocidad de las reacciones químicas y enzimáticas. Las células y tejidos de eucariotes superiores tales como esperma, células en cultivo, embriones, sangre y productos de tejidos son normalmente preservados en nitrógeno líquido o congeladores mecánicos diseñados específicamente para la preservación criogénica.
Si bien la refrigeración es generalmente categorizada por los científicos en 4ºC, -20ºC y -80ºC, para la preservación por largo tiempo se requieren temperaturas criogénicas, temperaturas por debajo de la temperatura de transición vítrea del agua. Esta es la temperatura a la cual cesa toda actividad biológica y es generalmente aceptado su valor en -130ºC (Comité en Fuentes de Plasma Germinal, 1978). Es bien conocido que el "congelamiento" de muestras biológicas en sí mismo no es adecuado para la preservación porque pueden ocurrir profundos cambios en las muestras congeladas (por ejemplo, las quemaduras por congelamiento). Las actividades químicas y biológicas pueden persistir mientras exista la actividad del agua, sin embargo debajo de -130ºC se detiene toda actividad. Estas temperaturas criogénicas pueden ser alcanzadas y mantenidas por ambos tipos de refrigeración, mecánica o con nitrógeno liquido. Una evaluación realizada en 1990 sobre programas de preservación de médula ósea reveló que en la mitad de los programas se utilizaba refrigeración por nitrógeno líquido y en la otra mitad se utilizaba refrigeración por vapores de nitrógeno líquido o refrigeración mecánica (Areman y col., 1990).
Por décadas los congeladores y los termos de nitrógeno líquido han sido utilizados para la preservación de cultivos de tejidos. Originalmente la preservación abarcaba colocar células en su etapa de crecimiento logarítmico en ampollas de vidrio que eran selladas, congelar la ampollas hasta -80ºC controlando la velocidad de congelamiento y luego sumergir las ampollas en nitrógeno líquido. El único cambio significativo que se realizó en este método fue la introducción de tubos plásticos criogénicos que permitían el congelamiento con menos esfuerzo. Aparte de este cambio, los métodos han permanecido básicamente inalterados y aceptados. Sin embargo, durante la última década, la aplicación del cultivo de células animales en la manufactura de productos farmacéuticos y su utilización como agentes terapéuticos ha demandado una examinación más exhaustiva de los métodos de preservación.
Los métodos empleados para preservar exitosamente células y tejidos de eucariotes por largo tiempo no requieren únicamente de temperaturas inferiores a -130ºC sino que también deben prevenir cualquier alteración de las muestras. Ha sido demostrado que la falta de controles adecuados en la criopreservación es perjudicial como en cualquier proceso. En particular, algunos investigadores han comunicado haber experimentado dificultades asociadas con los sistemas de congeladores con nitrógeno líquido, específicamente el riesgo potencial de la contaminación de las muestras y la formación de gradientes de temperatura que resultan en la preservación a temperaturas superiores a los -130ºC.
Eventos sobre contaminación.
El nitrógeno líquido no solamente se comporta como un refrigerante sino que, a semejanza con el agua, puede también actuar como un vehículo de transmisión de virus, bacterias, hongos y células animales. El reporte de que virus infecciosos fueron encontrados en nitrógeno líquido y que por ello debería manejarse como un material de riesgo biológico (Schafer y col., 1976), es indicativo del problema potencial de contaminación del nitrógeno líquido. El sumergimiento de tubos plásticos con tapa a rosca permite el contacto entre el nitrógeno líquido y la muestra. La condensación de la atmósfera dentro del tubo genera un vacío que puede hacer penetrar el nitrógeno líquido. Cualquier contaminación del nitrógeno líquido podría contaminar la muestra. Por ejemplo, las células stem y de médula ósea extraídas de un paciente en tratamiento citotóxico resultaron contaminadas con el virus de la hepatitis B por haber sido preservadas en nitrógeno líquido y causaron un brote de virus de hepatitis B (Tedder y col., 1995). De los seis pacientes afectados se encontraron en el nitrógeno líquido: antígeno A de superficie del virus de la hepatitis B, ADN del virus de la hepatitis B y ADN humano correspondiente a dichos pacientes. La observación que interesa es que el ADN de los pacientes y por ello presumiblemente sus células, fueron encontradas en el nitrógeno líquido indicando que los contaminantes se desplazan en ambos sentidos, hacia dentro y hacia afuera de los contenedores de preservación. Un estudio de seguimiento de este brote de virus de hepatitis B confirmó las fuentes del ADN humano y del virus de la hepatitis B por análisis de secuencia (Hawkins y col., 1996).
Fountain y col., (1997) llevaron a cabo un survey sobre la contaminación de hongos y bacterias en congeladores de nitrógeno líquido utilizados para preservar células stem hematopoyéticas. De los 583 cultivos examinados, 1,2% fueron encontrados contaminados por microorganismos. Sin embargo, cuatro de los cinco congeladores examinados contenían un bajo nivel de contaminación, mientras que el quinto congelador estaba altamente contaminado con Aspergillus. Los microbios contaminantes hallados en los congeladores fueron similares a los microbios encontrados en los cultivos contaminados. Si bien no se cita al nitrógeno líquido como fuente de contaminación, otros reportes demuestran la común aparición de contaminación microbiana de células stem criopreservadas (Prince y col., 1995; Lazarus y col., 1991; Stroncek y col., 1991; Webb y col., 1996). En nuestro laboratorio, se encontró que un pequeño tanque de nitrógeno líquido estaba contaminado predominantemente por Bacillus.
Gradientes de Temperatura.
Un segundo problema observado en los congeladores de nitrógeno líquido es la falta de homogeneidad en la temperatura de la cámara. Los sistemas de nitrógeno líquido funcionan por llenado de la parte inferior del contenedor con nitrógeno líquido y permitiendo que el vapor enfríe la cámara superior. Con los contenedores pequeños de laboratorio del tipo dewar, se llena el tanque entero y luego se permite que evapore durante un período de tiempo. Al comienzo de dicho período las células preservadas en los cubículos de la parte superior de la cámara se hallan a -196ºC y, mientras bajan los niveles del vapor de nitrógeno líquido, se produce un gradiente de temperatura desde el líquido hacia arriba. En los grandes congeladores de nitrógeno líquido se han registrado gradientes de la fase vapor que cubren desde la temperatura de transición vítrea del agua hasta llegar, según el caso, a -72ºC (White y Wharton, 1984), -70ºC (Wolfinbarger, 1998) o -95ºC (Rowley y Byrne, 1992). Estos amplios rangos de temperatura observados en los sistemas de preservación en nitrógeno líquido son inherentes a su modo de operación.
Si bien la contaminación potencial de las células preservadas es una amenaza para su integridad, la prolongada preservación a temperaturas por debajo de la temperatura de transición vítrea del agua provocará de hecho la pérdida de su viabilidad. Se estima que por debajo de -130ºC, inclusive las células más sensibles a la temperatura sobrevivirán por cientos de años. Sin embargo, por encima de dicha temperatura la longevidad de las células se reduce a meses.
Las dificultades de preservar muestras en nitrógeno líquido son aumentadas por la paradoja de que 1) preservar las células en vapor acarrea el riesgo de la pérdida de viabilidad y 2) preservar los tubos sumergidos en nitrógeno líquido aumenta el riesgo de la contaminación de la muestra. Una alternativa es la refrigeración mecánica, la cual puede ser utilizada para preservar muestras debajo de la temperatura de transición vítrea del agua sin el mismo miedo a la contaminación y a la inestabilidad de la temperatura. Hasta la aparición del congelador auto-cascada con mezcla de refrigerantes en los años 80, los congeladores de laboratorio no estaban preparados para alcanzar y mantener temperaturas debajo de la temperatura de transición vítrea del agua. Estas unidades están ahora disponibles y son utilizadas para la preservación criogénica.
Fig. 1. Comparison of the temperature distribution in a liquid nitrogen freezer and mechanical cryogenic freezer. The temperature of the liquid nitrogen is -196°C while the freezer is set at -135°C. Numbers represent temperatures (°C) at relative locations within the freezers. Shaded area in the liquid nitrogen freezer represents the liquid phase. Columnar boxes are to designate relative positions of temperature measurements within the chambers.
Alternativas de congelamiento mecá-nico.
Los congeladores tradicionales de laboratorio no podían llegar a temperaturas suficientemente bajas como para poder preservar células animales por tiempo prolongado. En los comienzos de los años 80, los ingenieros de Queue Systems desarrollaron una alternativa tecnológica a los sistemas de congeladores de nitrógeno líquido. Esta tecnología, conocida como congeladores auto-cascada, fue adoptada por Revco y utilizada para alcanzar y sostener -130ºC para la preservación prolongada de células animales. El sistema auto-cascada es un sistema único de refrigeración que emplea un compresor orbital y una mezcla de múltiples refrigerantes. A diferencia de los congeladores de nitrógeno líquido, los conductos de evaporación (por ejemplo, los elementos de enfriamiento) de los congeladores criogénicos rodean las paredes de la cámara y quitan el calor en toda la extensión de la cámara. En contraste, los congeladores de nitrógeno líquido dependen de la evaporación del refrigerante para enfriar la cámara. En la práctica, un gradiente debe formarse desde el nitrógeno líquido hasta la parte superior de la cámara. La diferencia práctica entre ambos sistemas es que la refrigeración mecánica provee un ambiente generalmente uniforme en la cámara mientras que los congeladores de nitrógeno líquido generan un gradiente de temperatura. Una comparación realizada entre un congelador equipado con un compresor orbital y un congelador común de nitrógeno líquido demuestra las diferencias entre los dos sistemas de criopreservación como se observa en la figura 1 (White and Wharton, 1984). Cualquier exposición, periódica o prolongada, de células criopreservadas, a temperaturas superiores a -130ºC es perjudicial para la viabilidad de las células. Con congeladores de nitrógeno líquido, altas temperaturas en los gradientes han sido observadas y citadas como problemas en varias oportunidades (White y Wharton, 1984; Wolfinbarger y col. 1996; Rowley y Byrne, 1992). Los efectos del entibiamiento celular podrían abarcar la lisis celular, actividad enzimática continua y pérdida de agua de las células. Consecuentemente, en el caso de especímenes valiosos e irremplazables, los gradientes o fluctuaciones de temperatura deberían ser evitados. Los congeladores mecánicos proveen la necesaria estabilidad de la temperatura para la criopreservación de células sensibles.
El problema de la contaminación observado con el sumergimiento de los tubos de criopreservación en nitrógeno liquido pueden ser también solucionados con los congeladores criogénicos. La entrada de nitrógeno líquido a los tubos sumergidos ocurre debido a la formación de un vacío causado por la condensación del nitrógeno gaseoso. La presión en tal tubo descenderá desde 1 atmósfera a menos de 0,01 atmósferas. Consecuentemente, cualquier tubo defectuosamente cerrado atraerá el líquido (y contaminantes) hacia adentro. Con un congelador criogénico, la caída de presión es mucho más insignificante, desde 1 atmósfera a 0,48 atmósferas, resultando en un vacío más débil. Si bien no hay datos acumulados sobre la contaminación de la atmósfera del congelador, normalmente la densidad de los contaminantes del ambiente es menor que la misma en la fase líquida. De ahí que la contaminación de los viales preservados en un congelador deberían ser significativamente más bajos que en el caso de tubos comparable sumergidos en nitrógeno líquido.
Futuras aplicaciones.
El crecimiento de la automatización en los laboratorios ha provocado la demanda de una gran capacidad de almacenamiento en formatos de microplacas de cultivo con células animales. En nuestro laboratorio se están llevando adelante estudios para desarrollar métodos para la preservación de células animales en microplacas de cultivo a temperaturas inferiores a -130ºC. Este formato permitirá una gran capacidad de almacenamiento y proveerá una conexión entre la preservación de las células y la automatización del laboratorio. La meta final de este esfuerzo es reducir la variabilidad de las células criopreservadas y su subsecuente utilización. Esta aplicación tiene posibilidades de lograr la reducción de la variabilidad fisiológica de las células utilizadas en ensayos biológicos.
Referencias.
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